CRY1과 CLOCK:BMAL1간의 repressive complex 형성 분석

제목	CRY1과 CLOCK:BMAL1간의 repressive complex 형성 분석
추천 연구 논문	Formation of a repressive complex in the mammalian circadian clock is mediated by the secondary pocket of CRY1
선정 이유​	Regulatory complexes of core clock proteins는 하루 중의 CLOCK:BMAL1 activation과 repression의 dynamic balance를 유지하게 한다. CRY1은 CLOCK:BMAL1과 결합하여 CRY1:CLOCK:BMAL1 ternary complex를 형성하게 되는데, 이는 circadian feedback loop를 repression하는 것에 있어 중요한 complex이다. 따라서 CRY1이 어디에, 어떻게 결합하여 complex를 형성하는 지를 아는 것은 circadian rhythm을 조절하기 위한 연구를 하는 것에 있어 중요한 정보이다. 이 연구팀은 이와 관련한 부분을 연구하였기에, 이 논문을 선정하였다.
주요 내용	CLOCK PAS-B의 HI loop가 CRY1을 통한 CLOCK:BMAL1 억제에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 실험을 진행하였다. W362A 변형을 통해 CRY1과의 결합을 테스트해 이 변형이 CRY1:CLOCK:BMAL1 형성을 방해하는 것을 발견하였고, 이는 CLOCK PAS-B의 tryptophan이 CRY1의 stable association에 중요함을 나타냄. 이를 기반으로, 해당 연구팀은 HADDOCK을 사용하여, computational model을 만들어 docking을 진행했다. Active restraints로 CRY1의 secondary pocket과 CLOCK PAS-B 주요 잔기를 선택해 집중적으로 연구하였다. 해당 연구는 5T5X, 4F3L 이미 밝혀진 구조 정보를 참고하여 반응에 중요한 loop를 관찰하였다. Docking simulation을 통해 통합적인 분석을 진행하였고, CRY1:CLOCK PAS-B complex formation이 elimination되는 결과를 도출하였다. 이러한 결과로 CRY1의 secondary pocket과 CLOCK:BMAL1 complex간의 direct interaction의 존재를 입증했다. 다음으로, SAXS를 사용해 CRY1 PHR과 CLOCK:BMAL1 bHLH PAS-AB heterodimer의 behavior를 분석하였다. 이후, FoXS를 이용하여 해당 단백질들의 crystal structure를 예측하고, 이와 SAXS에서 얻은 실험 data를 비교하여, 기존 CLOCK PAS-B domain crystal structure의 flexibility를 실험값과 비교하여 아주 높은 해상도를 가지는 구조를 제작하였다. 마지막으로, ternary complex의 low resolution model을 만들기 위해, SEC로 purification을 하고, SAXS로 data를 수집했다. 이후 연구팀은 ternary complex model을 평가하기 위해, FoXSDock을 사용하여 SAXS로부터 얻은 실험 데이터와 계산하여 예측하였던 데이터를 평가하고 CRY1:CLOCK:BMAL1간의 interaction을 입증하였다.
시사점	해당 연구팀은 GST pull-down experiment, SEC, SAXS와 같은 experimental test와 HADDOCK, FoXSDOCK과 같은 computational test를 적절하게 조합하여 연구를 진행하였다. 실험적으로 나온 결과를 토대로 computational 기술을 사용하여 재평가하고, 반대로 computational 기술을 사용하여 나온 결과를 실험 결과와 비교하여 결과를 합리적으로 입증하였다. 결과 데이터를 한 쪽 관점에서만 분석 및 평가하지 않고, 다방면에서 비교 및 분석을 하였다는 점에서 다양한 분야의 연구에서 나온 결과들의 비교가 중요하다는 인지할 수 있다. 또한, CRY1의 어느 부분(Tryptophan in secondary pocket)이 CLOCK:BMAL1 complex에 어떻게 상호작용하여 어떠한 원리로 circadian clock의 repressed state을 만드는 지에 대해 분석하였기 때문에, CRY1과 CLOCK:BMAL1간의 repressive complex 형성을 조절할 수 있는 약물 설계에 도움이 될 것이라 기대된다.